生成した（図2B）。さらに大腸菌由来の20種類のaa-tRNAaaを用いて網羅的に基質特異性を調べたところ、驚いたことに、Sba18はGly-tRNAGlyだけでなくAla-tRNAAlaおよびSer-tRNASerを基質として新規化合物を生産した（図2B）。Orf11とSba18は高い相同性を有するが、その基質特異性は全く異なり、Sba18はaa-tRNAaaのアミノアシル基、tRNAaa分子の両者に広い基質認識機構を持つaa-tRNAaa依存型アミド合成酵素であることが判明した。 そこで次に、Sba18のより詳細な基質認識機構を解明するために、tRNAGly、tRNAAla、tRNASerをin vitro合成し、人工RNA触媒Flexizymeを使って非天然型Gly-tRNAaaを調製して酵素反応を行った（図3）。その結果、Sba18は全てのGly-tRNAaaを基質認識し、GTを生成した。さらに興味深いことに、tRNAGlyのacceptor stem構造のみからなるtRNA mimic基質Microhelix RNAを基質とした場合においても、Sba18はGTを生成したことから、Sba18のtRNAaa基質認識には、acceptor stem構造が重要であることが判明した。また、aa-tRNAaaにおけるアミノアシル基に対する基質特異性を調べるために、人工合成したtRNAGlyをFlexizymeにて様々なアミノ酸でアミノアシル化し、aa-tRNAGlyに対する基質選択性を評価したところ、23種類のaa-tRNAGly人工基質のうち、14種類を基質認識し新規GT類縁化合物の創製に成功した。本研究によってSba18の広い基質特異性を活用したGT類縁化合物の多様性創出が可能となり、今後は有用な生理活性を持つ新規GT類縁化合物の創成への応用が期待される。 3. 今後の展開（計画等があれば） ST類縁化合物の一つであるSF-2111B（図1）は特徴的なO-アシルペプチド構造を有しており、本ペプチド構造を持たない生合成前駆体と比較して、植物病原性真菌に 図3 (A) tRNAaaのin vitro合成法 (B) Flexizymeを用いた非天然型Gly-tRNAaa合成法 対する抗菌活性が強くなることが知られている。そこで本ペプチド構造の生合成に関わる遺伝子群を取得するために、SF-2111B生産菌のゲノム解析を行い、BD-12生合成遺伝子群に相同性を示す遺伝子群の探索を行ったところ、約50 kbpの生合成遺伝子群を見出した。次にSF-2111B生産菌のゲノムライブラリーを構築し、本遺伝子群の全長を有するBACクローンの取得および異種放線菌を宿主とした異種発現実験を行った結果、SF-2111Bの生産が確認され、我々が見出した遺伝子群にSF-2111B生合成に関わる全ての遺伝子セットを含んでいることを明らかした。これまでに得られた本遺伝子群に含まれる酵素遺伝子の機能解析を進めた結果から、図4に示す生合成経路を明らかにした。しかしながら、O-アシルペプチド構造を共通骨格に付与する反応を触媒する酵素遺伝子については未だ未同定である。生合成工学によってO-アシルペプチド構造を持つST類縁化合物を創製するには最も重要な酵素遺伝子であるといえ、本年度は本酵素遺伝子の同定に注力したい。 図4 SF-2111Bの推定生合成経路 4. 参考文献 1) C. Maruyama, J. Toyoda, Y. Kato, M. Izumikawa, M. Takagi, K. Shin-ya, H. Katano, T. Utagawa & Y. Hamano: Nat. Cham. Biol., 8, 791 (2012). 2) C. Maruyama, H. Niikura, M. Izumikawa, J. Hashimoto, K. Shin-ya, M. Komatsu, H. Ikeda, M. Kuroda, T. Sekizuka, J. Ishikawa & Y. Hamano: Appl. Environ. Microbiol., 82, 3640 (2016). 5. 連絡先 福井県立大学・生物資源学部、住所：福井県吉田郡永平寺町松岡兼定島4-1-1、Tel：0776-61-6000、e-mail：hamano@fpu.ac.jp T7 promoterGGAUCGAAAGAUUUCCGCAGGCCCGAAAGGGUAUAUUGGCGUUAAGGUCCAAHOCCAAsynthetic DNA of tRNAaa genein vitro transcription reactiondenaturedat 95Crefoldedat R.T.tRNAGlytRNAAlatRNASer(A)(B)OO2NNO2NH2OFlexizymeGly-DBEribozyme acylationOOOOOOGly-tRNAGlyGly-tRNAAlaGly-tRNASeracceptor stemMicrohelixRNAOOGly-MicrohelixCCAACCAACCAACCAACCAACCAAOHNH2OHOONH2OHOAMPNHHNNHNOOHHHOOHOH2NONNHOOHATPPPiASHNOHOOHOOCTCOrf1197Orf1198SHNOHOOOOCTCOHH2NOAMPSNH2OHOSOOOHCoACTCATPPPiSHNOHOHNOOCTCOHONHHNNHNOOHHHOOHOH2NONNHOOHNHNOHOOHOOOOrf1196Orf1196?SF-2111BL-SerL-Alamethyl malonyl-CoA−111−
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